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    发布日期:2018-04-08

详细介绍

Phagemid pComb3 Vector

Introduction

The original pComb3 vector was designed for phage display of Fabs which are cloned in one chain at a time using SacI/XbaI restriction sites (for the light chain) and XhoI/SpeI restriction sites (for the heavy chain). This vector system has also been used for the display of a wide variety of other proteins like zinc fingers, peptides, and cDNA fragments. Phage can be produced which express Fab or other proteins or peptides of interest fused to the phage pIII protein for expression on the head of the phage. Soluble Fab can be expressed by removing the gene for the pIII phage fusion protein by SpeI/NheI digest. Sufficient soluble protein is also found in the periplasmic space as a result of proteolysis.

噬菌体载体pComb3是在噬菌体载体pBluescript的基础上,由美国Scrips研究所创建的,已被广泛运用于天然时间菌体抗体库的构建和Fab段抗体的表达。噬菌体载体pComb3的构建是将抗体的Fd链(包括VHCH1结构域)与噬菌体外壳蛋白IIIpIII)上的C端区域相连接形成的融合蛋白。在表达的Fab蛋白与噬菌体外壳蛋白pIII蛋白质间有一灵活的缺乏规则二级结构的5肽(Gly4Ser)相连形成最微量化的相互作用,Fd/pIII融合蛋白和轻链蛋白基因分别被置于Lac启动子/控制子的序列控制之下,翻译成蛋白后分别通过pelB先导序列被导入细菌的细胞膜间隙,重链Fd通过与pIII融合镶嵌在膜上,而轻链则独自分泌入膜间隙,重链和轻链在膜上组装成有活性的Fab抗体。由于噬菌体载体pComb3仅含有噬菌体F1的原始复制区域,只有在加入辅助噬菌体VCSM13的情况下才能复制和包装成完整的噬菌体病毒。当带有外源基因的pComb3质粒DNA转化细菌后,在辅助噬菌体的感染拯救下,通过细胞内基因重组后形成重组的噬菌体,此时的噬菌体带有两种外壳蛋白III的形式:一种是带有Fab抗体的融合蛋白形式,Fab蛋白在噬菌体组装分泌过程中通过与pIII蛋白融合表达而表达在噬菌体的顶部;另一种形式是形成噬菌体天然的外壳蛋白III。这种Fab/pIII融合蛋白可与抗原结合而被用于特异性筛选,而天然的pIII蛋白则保持噬菌体对细菌的感染性,使重组的噬菌体得以增殖。噬菌体载体pComb3带有氨苄抗性基因,而辅助噬菌体VCSM13带有卡那霉素抗性基因,因此在氨苄和卡那霉素的药物作用下,只有带有pComb3的重组噬菌体才能增殖,从而起到了一个选择增生的效果。可溶性表达重组抗体的过程是,将以上获得的融合表达性重组噬菌体,运用SpeINheI进行酶切,切去位于重链Fd片段和轻链片段之间的Gly4Ser肽段和pIII蛋白。再进行连接成完整的表达性载体,重链和轻链则在pelB先导序列的定位下,穿过细胞内膜到达膜间隙中,而形成可溶性的Fab片段。



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