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噬菌体抗体技术

时间:2013-12-20 18:32来源:北京宝科维食安生物技术有限公司

噬菌体抗体技术
                                                                                                                                                                   张爱华 余模松(国际生物制品学杂志2006年2月第29卷第1期)
       20世纪80年代,随着DNA重组技术的进展和抗体基因结构的阐明,产生了基因工程抗体技术。早期用于构建基因工程抗体的抗体基因主要来源于小鼠杂交瘤细胞。由于要获得杂交瘤细胞必须经过动物免疫、细胞融合及克隆筛选这样一个长期、复杂的过程;而且利用杂交瘤技术很难制备人源抗体和抗自身抗原或弱免疫原性抗原的抗体,所以限制了基因工程抗体技术的推广和应用。20世纪90年代,人们又将噬菌体展示技术应用到抗体的表达和克隆,将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因文库和抗体在大肠杆菌功能性表达与高效快速的筛选手段结合起来,产生了噬菌体抗体库技术,这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,由此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。
        一、噬菌体展示技术
       1985年Smithc首次阐述了噬菌体展示技术。该技术通过将外源蛋白或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该外源分子呈现于噬菌体表面。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内,即在噬菌体表面表达特定蛋白,而在噬菌体核心DNA中含有该蛋白的结构基因。通过表型筛选就可以获得其编码基因,因此噬菌体展示技术是一种强有力的基因表达筛选技术。
        蛋白质可以展示在更小的丝状噬菌体颗粒的表面,这就是噬粒展示系统。噬粒的基因组中包含丝状噬菌体的基因间隔区,包括病毒颗粒和互补链合成的复制起始点以及发夹包装信号,同时也含有质粒的复制起始点和抗性基因。噬粒也可以像质粒一样操作,假如需要,可以直接在细菌中表达目的蛋白。采用丝状辅助噬菌体感染细菌可以激活噬菌体的复制起始点,从而导致单链噬粒DNA被包装进由辅助噬菌体蛋白形成的丝状噬菌体样的颗粒中,由于辅助噬菌体缺乏包装信号,所以产生的大多数噬菌体为含有噬粒单链DNA的颗粒,将这种噬粒和噬菌体混合物感染细菌,筛选具有抗性的克隆,这种带抗性的克隆只含有噬粒DNA,可再次通过辅助噬菌体的感染进行扩增。由于噬粒颗粒可以传播抗性基因,所以有时又把这种颗粒称为“转导颗粒”。
        P 11蛋白是一种最常用于展示外源片段的噬菌体外壳蛋白。其缺点是每个噬菌体颗粒表面仅有5个P1分子,但是它的优点是带大的插入片段的P 1分子可以被很好地包装进噬菌体颗粒中。在绝大多数情况下,外源蛋白插入在信号序列和P 11蛋白第一结构域(N1)的起始位点之间,一方面外源蛋白不影响噬菌体的包装,另一方面,外源蛋白位于包装颗粒的最末端,所以当通过PⅣ蛋白孔时,其空间位阻较小。但问题是大片段的插入降低了噬菌体的感染能力,甚至使噬菌体无感染性,因此限制了某些特殊蛋白的选择。
        这一问题可以通过杂交噬菌体得到解决,即仅有一个P 11分子用于展示蛋白,具体方案是将外源蛋白构建到噬粒载体中,转化细菌后,再用辅助噬菌体超感染,这样细菌中的大多数P 11蛋白为来源于辅助噬菌体的野生型分子。噬菌体展示活性蛋白的能力主要依赖于以下几个方面的因素,比如融合蛋白能否被正确地转移到细菌内膜,能否正确地折叠,能否在外周质中逃避降解以及能否被包装进噬菌体颗粒中。外源蛋白也可以插入到P 1蛋白的N1和N2以及N2和CT结构域之间,如果N1和N2相互作用形成纤毛结合位点,外源蛋白的插入仍能保留噬菌体颗粒的感染性,揭示在N1和N2之间插入外源片段,可以得到耐蛋白酶的外源蛋白。
        二、噬菌体抗体库技术
        1989年英国剑桥Winter小组率先在Nature上发表了关于抗体库构建的文章,他们采用PCR技术从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA 中扩增出VH基因,测序证实了其多样性,并在大肠杆菌中表达r VH片段;紧接着美国Scripps研究所Lerner小组在Science上发表了关于完整抗体库构建的文章,他们用反转录PCR技术从淋巴细胞克隆出全套抗体的轻链基因和重链Fd段基因,通过DNA重组技术将轻链基因和重链Fd段基因随机配对重组于一个噬菌体表达载体中,形成组合抗体库。将所得到的抗体库DNA经体外包装后感染大肠杆菌,在质周腔折叠形成有功能的Fab段,释放于噬菌斑内,用标记抗原筛选到产生特异性抗体的克隆,得到其Fab段的基因,从而成功地建立起了完整的抗体库技术。但是上述利用入噬菌体载体,通过噬菌斑印迹筛选抗体的抗体库技术在出现不到一年就被更为优越的噬菌体抗体库技术所取代,1991年Winter小组和Lerner小组又分别发表论文阐述了利用嘴菌体展示技术构建抗体库,这是将噬菌休展示技术应用于抗体库技术所取得的重大进展。
        2.1免疫与非免疫抗体库
        免疫抗体库是指采用经过免疫(包括疫苗注射、微生物感染、自身免疫疾病、肿瘤等)后的淋巴细胞所构建的抗体库,由于用于构建这些抗体库的淋巴细胞已在体内经过抗原选择和亲和力成熟,因此从较小库容(105~10 6)就可以筛选到特异性强的高亲和力抗体。非免疫抗体库包括天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。天然抗体库是指采用 经过免疫的淋巴细胞构建的抗体库,半合成抗体库是指人工合成一部分可变区序列与另一部分天然序列组合构建抗体库,全合成抗体库是指抗体可变区序列全部由人工合成。
        从理论上讲,可以从库容量大的天然或半合成抗体库中筛选到任何所需要的高亲和力的特异性抗体。事实上。通过这一途径已获得了许多中等或高亲和力的抗体分子,并且其特异性也可以满足大多数需要。因此如果仅仅把抗体分子作为追踪特异性分子的工具,采用非免疫抗体库是一个良好的切入点。然而。如果从这种文库中得不到所需亲和力的抗体分子,或者需要一组针对特异性抗原的抗体,以及对抗体的生物学应答的研究,免疫抗体库则是最佳选择。虽然从大的非免疫抗体库中得到的中等亲和力的抗体分子,其亲和力通过诱变或选择很易得到改进,但事实上还不如构建一个免疫抗体库来得方便。目前英国剑桥抗体技术中心和德国慕尼黑MorphoSys AG 已构建了大容量的、半合成的或非免疫的人的抗体文库。
        2.2不同物种的免疫抗体库
        如果抗体用于人体治疗,那么人的抗体库作为首选。黑猩猩或恒河猴,由于其免疫球蛋白的遗传基因非常接近于人的基因,所以可作为替代物。也可以从载有人的外周血淋巴细胞或人的抗体基因文库的严重联合免疫缺陷症(SCID)小鼠中获得人的抗体基因。由于采用杂交瘤技术很容易得到鼠源性单克隆抗体,所以采用小鼠作为免疫动物很方便。用于构建小鼠抗体库的引物(尤其是Balb/c小鼠)和方法均已有报道 ,采用小鼠的优越性是可以广泛获得用于枪测鼠源性抗体的二级试剂,但重链氨基末端序列的多样性使得必须采用许多PCR引物以保证所构建文库的代表性。
        构建兔抗体库具有许多优点:(1)与小鼠相比,在免疫应答过程中兔的抗体基因重排较少,这样就降低了PCR引物的数量;(2)兔的形体较大,可以获得更多的组织用于文库的构建,并且容易采血。也可以采用免疫鸡来构建文库,像兔一样,鸡的抗体胚系基因也较少。此外,与实验审哺乳动物比较,禽类的种系距离人类更远,这样就可以通过构建禽类的抗体库来获得针对在进化过程中高度保守分子的抗体。
        2.3免疫抗体库的组织来源
        对于免疫抗体库,一般采用对靶抗原具有高血清抗体滴度的供者或动物的组织,因为高血清抗体滴度可以反映高水平的抗体产量,从而可以得到高产晕的特异性的mRNA用于文库的构建。Persson等从采用20年前免疫过麻疹疫苗的供者骨髓构建的文库中仅筛选到一株特异性的Fab抗体,相反从来源于高血清滴度供者组织构建的文库中。可以筛选到成组的结构多样性的Fab,因此在义库构建开始以前,对潜在的供者进行血清学研究十分关键。
        一般而言,在收集组织的时候同时采集大量供者的血清,并将其分装成小份保存将极大地有利于文库构建后的研究。文库构建中组织来源的选择十分关键,最理想的组织是其中含有最丰富的分泌特异性抗体的浆细胞,因为其中特异性的mRNA丰度最高。以人对破伤风类毒素的抗体应答为例,当再次接受该抗原刺激后,在很短的时间内,如3~10天,外周血中分泌抗体的特异性浆细胞的数量明显上升,事实上,已从采用这种加强免疫后的外周血淋巴细胞构建的文库中筛选到了抗破伤风类毒素的Fab。但是如果抗原加强后,间隔较长时间可观察到外周血中分泌抗体的特异性浆细胞的数量急剧降低,这种下降似乎反映了机体可将特异性B细胞运输到长期产生抗体的解剖部位这一机理,并且这一机理也可以解释为什么从用高血清滴度但未加强免疫的供者的淋巴细胞构建的文库中筛选不到抗破伤风类毒素的Fab。在人体中,抗体生成细胞主要定居在骨髓中,所以骨髓常常作为构建文库的组织来源口 。实验表明,从采用单个供者骨髓构建的文库中,已筛选到许多针对不同病原性抗原的抗体,且供者并未进行加强免疫 。也可以采用其他组织进行文库的构建,包括脾脏、淋巴结和扁桃体。
        2.4单链抗体(ScFv)文库与Fab抗体文库的比较
        对抗体文库构建者而言,首先需要考虑的问题是构建单链抗体(ScFv)文库还是Fab抗体文库。单链抗体文库的主要优点有:(1)由于采用基因重叠拼接的PCR方法,有效地减少了文库构建的步骤,简化了文库的构建;(2)ScFv的多聚化增强了与抗原的解离能力,从而使筛选某些抗原分子如细胞表面分子更加容易;(3)在大肠杆菌中表达ScFv比Fab容易,因为其分子量较小。ScFv的主要缺点是有形成寡聚体的倾向,因此如果最终要得到完整的抗体分子,那么ScFv不是最佳选择,这是因为通过体外技术可以改进ScFv的亲和力,但这种改进是通过寡聚体的改变而实现的,其ScFv本身的亲和力并未得到改善 。
         Fab分子的优点在于它是一种稳定的、性质明确的蛋白片段。尽管Fab是完整抗体分子的一部分,但实际上它具有与抗原结合的独立功能。此外,Fab分子一般不形成多聚体,Fab亲和力的改进就代表其本身亲和力的改善,Fab可以很容易地转化成完整的抗体分子。与ScFv相比,Fab最大的缺点是在大肠杆菌中的表达量较低。
        2.5噬菌体抗体的应用
        1989年Block等报道了采用PHAI ISA方法,将lacZ半乳糖苷酶基因与特异性抗单纯疱疹病毒抗原的抗体共价结合,然后与待测样本孵育,经过洗涤后,再采用高或低pH方法洗脱与抗原结合的噬菌体,然后感染大肠杆菌培养物,通过检测半乳糖苷酶活性来测定抗原存在与否。理论上由于单个噬菌体分子经过感染后也能检测到信号,因此认为其灵敏度较常规Elisa高,可以与PCR媲美。最近Lu等也报道了一种改良的PHALISA方法,具体方法是用鼠抗一HBs包被ELISA 板,加入待测HBsAg,然后再加入噬菌体抗-HBs,洗脱后的噬菌体感染大肠杆菌,通过测定噬斑来判定抗原存在与否。他们认为该法比常规ELISA法至少敏感20~l00倍,并对该法用于特异性抗原的筛选和检测进行了探讨。
       后记
         目前运用噬菌体展示技术构建重组抗体研究,在广大院校、研究院所以及生物制药公司甚为火热。在传统的杂交瘤融合法制备单克隆抗体发展到今天的阶段,广大生命科学工作者都在寻求一种新的方法和路径去追求更加便捷化、更加有效的抗体制备方法。同时,由于小分子重组抗体,在组织渗透性能、可改造性以及独特的兼具表型与基因型性能,更是收到热捧。
scFv展示系统,主要是基于pCANTAB5e噬菌粒,配合融合表达宿主菌TG1、可溶性表达宿主菌HB2151以及辅助噬菌体M13K07完成重组抗体、或是多肽的展示。
Fab展示系统,主要是基于pcomb3噬菌粒,配合宿主菌XL1-blue及辅助噬菌体VCSM13完成重组抗体、或是多肽的展示。
        后继,我们还将多展示有关方面的研究最近进展和最近应用,敬请多关注,多交流。

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