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噬菌体展示系统

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pcomb3噬菌体展示系统

时间:2013-11-11 20:33来源:北京宝科维食安生物技术有限公司

pcomb3噬菌体展示系统
pcomb3 Phgedisplay System For Recombinant Antibody& Recombinant Protein Expression
Bio-Viewshine Code:PDS 27-9401-02
【原理】
  噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达,融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性,以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。
  噬菌体载体pComb3已被广泛运用于天然时间菌体抗体库的构建和Fab段抗体的表达。噬菌体载体pComb3的构建是将抗体的Fd链(包括VH和CH1结构域)与噬菌体外壳蛋白III(pIII)上的C端区域相连接形成的融合蛋白。在表达的Fab蛋白与噬菌体外壳蛋白pIII蛋白质间有一灵活的缺乏规则二级结构的5肽(Gly4Ser)相连形成最微量化的相互作用,Fd/pIII融合蛋白和轻链蛋白基因分别被置于Lac启动子/控制子的序列控制之下,翻译成蛋白后分别通过pelB先导序列被导入细菌的细胞膜间隙,重链Fd通过与pIII融合镶嵌在膜上,而轻链则独自分泌入膜间隙,重链和轻链在膜上组装成有活性的Fab抗体。由于噬菌体载体pComb3仅含有噬菌体F1的原始复制区域,只有在加入辅助噬菌体VCSM13的情况下才能复制和包装成完整的噬菌体病毒。当带有外源基因的pComb3质粒DNA转化细菌后,在辅助噬菌体的感染拯救下,通过细胞内基因重组后形成重组的噬菌体,此时的噬菌体带有两种外壳蛋白III的形式:一种是带有Fab抗体的融合蛋白形式,Fab蛋白在噬菌体组装分泌过程中通过与pIII蛋白融合表达而表达在噬菌体的顶部;另一种形式是形成噬菌体天然的外壳蛋白III。这种Fab/pIII融合蛋白可与抗原结合而被用于特异性筛选,而天然的pIII蛋白则保持噬菌体对细菌的感染性,使重组的噬菌体得以增殖。噬菌体载体pComb3带有氨苄抗性基因,而辅助噬菌体VCSM13带有卡那霉素抗性基因,因此在氨苄和卡那霉素的药物作用下,只有带有pComb3的重组噬菌体才能增殖,从而起到了一个选择增生的效果。可溶性表达重组抗体的过程是,将以上获得的融合表达性重组噬菌体,运用SpeI和NheI进行酶切,切去位于重链Fd片段和轻链片段之间的Gly4Ser肽段和pIII蛋白。再进行连接成完整的表达性载体,重链和轻链则在pelB先导序列的定位下,穿过细胞内膜到达膜间隙中,而形成可溶性的Fab片段。
  噬菌体展示技术成为探测蛋白空间结构、探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻找高亲和力和生物活性的配体分子的有利工具,在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制以及肿瘤治疗等研究领域产生了深远的影响。肽库(peptide library)的应用为确定表位序列以至其构象提供了另一有力工具。
【内容】
  A.表达宿主菌XL1-Blue(15%甘油保存);
  B.噬菌粒载体pcomb3(DNA溶于TE Buffer,浓度50ng/ul);
  C.辅助噬菌体VCSM13(滴度为1.2×1012pfu/ml);
【保存】噬菌粒载体、宿主菌保存于-20℃。辅助噬菌体请存放在4℃即可,不可冻存。
【其他说明】详细说明请参考 请点击查看PDF

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